Hepatitt E-virus (HEV) diagnostikk: RNA ekstraksjon, revers transkripsjon og revers transkriptase PCR (RT-PCR). Validering og optimalisering av metoder for påvisning av HEV-infeksjon

Abstract

Bakgrunn: Hepatitt E-virus (HEV) er et lite (28-35 nm), nakent, icosahedralt virus med et enkelttrådet RNA genom med positiv polaritet, som er klassifisert i familien Hepeviridae. Det er estimert at 20 millioner smittes av viruset årlig, og at seroprevalensen av HEV i Norge er 14 %. Selv om tallene kan tyde på at infeksjoner med HEV er relativt vanlig også i Nord-Norge, manglet Universitetssykehuset i Nord-Norge metoder for påvising av HEV-infeksjon. Formål: Finne, validere og optimalisere en metode for HEV RNA deteksjon og kvantisering i blod som kan tas i bruk ved Avdeling for mikrobiologi og smittevern ved Universitetssykehuset Nord-Norge. Metode: Oppgaven sammenligner resultater fra en kommersiell HEV RT-PCR test, RealStar HEV RT-PCR, med resultater fra en tidligere publisert og mye benyttet in-house HEV RT-PCR metode. Da den modifiserte versjonen av RealStar HEV RT-PCR ikke er validert for bruk, valideres og optimaliseres de ulike stegene i in-house RT-PCR metoden som RNA ekstraksjon, revers transkripsjon og RT-PCR. Resultater: RealStar HEV RT-PCR kvantiterte noe høyere enn in-house PCR, uten at vi vet om det er mer korrekt. Metodene har imidlertid lik sensitivitet. Begge metoder hadde 100 % rett på QCMD panelet og detekterte alle genotypene i genotypepanelet. Den mest effektive RNA ekstraksjon får en ved manuell ekstraksjon ved bruk av QIAamp med carrier RNA, men her er input volum begrenset til 140 µl. Også for EasyMag ekstraksjon gir 140 µl den mest effektive ekstraksjon men et høyere input volum gir høyere RNA konsentrasjon. Revers transkripsjon på 30 minutter gir bedre resultat enn 5 og 15 min reaksjonstid, men som et kompromiss mellom økt sensitivitet og tidsbruk vil vi benytte 15 min. 2-stegs amplifikasjon gir bedre resultat enn 3-stegs amplifikasjon. Mastermixen bør sammensettes av 400 nM eller 900 nM forward primer og 900 nM revers primer. For å unngå forbyttinger vil vi benytte 900 nM av både forward og revers primer. Dessuten vil vi benytte 250 nM probe som ga best resultat. Konklusjon: Da den optimaliserte in-house HEV RT-PCR metode gir 100 % score både på QCMD panel og genotypepanel, konkluderer vi med at denne metoden kan tas i bruk til HEV diagnostikk ved Avdelingen for mikrobiologi og smittevern ved Universitetssykehuset i Nord-Norge.