Etablering av metode for måling av inhibitorisk aktivitet mot cysteinproteaser og studier av cystatiner i makrofager og kreftceller

Abstract

Makrofager kan utgjøre en betydelig del av en kreftsvulst. Det er tidligere vist at monocytter ved differensiering mot makrofager uttrykker økte mengder av enkelte cysteinproteaser. Maligne celler er vist å bruke cysteinproteaser i forbindelse med metastasering, og endogene cysteinproteasehemmere antas å kunne hemme denne prosessen. Det var derfor interessant å studere reguleringen i uttrykk og aktivitet av cystatiner ved differensiering av monocyttiske celler mot makrofager.

Det ble etablert en funksjonell metode for måling av inhibitorisk aktivitet mot cysteinproteaser i laboratoriet ved hjelp av fluorometrisk måling med cysteinproteasen papain som enzym. Metoden ble brukt til å måle inhibitorisk aktivitet av cystatiner i THP-1 celler (en human monocyttliknende akutt leukemisk cellelinje), i diverse humane kreftcellelinjer, i diverse xenografter (human/mus), og i cystatin M-transfekterte HEK 293 celler (nyreepitelceller).

THP-1 celler ble stimulert med PMA (40 ng/ml) i 24 timer, og dyrket i opptil 10 dager. Ved stimulering med PMA gikk cellene fra å være frittlevende monocytter til å bli adherente makrofager. Grad av inhibitorisk aktivitet ble regnet ut i inhibitoriske enheter per mg totalprotein for cellelysater og inhibitoriske enheter per ml for cellemedier. En inhibitorisk enhet ble definert som den konsentrasjonen som må til for å hemme 50 % av papainaktiviteten. Uttrykk av cystatinene C, M og F ble analysert ved hjelp av immunodeteksjon (Western blotting). Det ble sett på endring av total inhibitorisk aktivitet over tid, og en eventuell sammenheng mellom inhibitorisk aktivitet og uttrykk av cystatin C, F og M.

Målingene i medieprøver fra cystatin M-transfekterte celler viste tydelig økt inhibitorisk aktivitet i de transfekterte cellene, noe som bekreftet at metoden fungerte for å måle hemming forårsaket av ekstracellulært cystatin M. Det ble observert en tidsavhengig økning i inhibitorisk aktivitet både i cellelysater og cellemedier. Uttrykk av cystatin C og M ble detektert, men ikke cystatin F. Det ble observert en sammenheng mellom den tidsavhengige økningen i ekstracellulær inhibitorisk aktivitet og uttrykk av ekstracellulært cystatin M.