Role of Laeverin in the pathophysiology of preeclampsia

Abstract

Preeclampsia is a pregnancy-specific disease, affecting 5-10% of human pregnancies worldwide. It is defined as new-onset hypertension after 20 weeks of gestation with either proteinuria and/or organ failure. Laeverin is a membrane-bound aminopeptidase exclusively expressed in the placenta. Our previous studies revealed a significant upregulation of laeverin mRNA in preeclamptic placentas, building the background for this doctoral thesis. Therefore, we adopted a translational approach aiming to investigate the possible role of laeverin in the pathophysiology of preeclampsia. First, we used immunofluorescence microscopic analysis of healthy third trimester placentas showing expression of laeverin protein in cell membrane of villous trophoblasts. In preeclamptic placentas however, laeverin was expressed ectopically in the cytoplasm, especially in microvesicles. Immunoelectron microscopy showed laeverin leakage into the fetal capillaries and abundant expression in microvesicles in preeclamptic placentas. Laeverin gene-silencing showed a reduction in migration and invasion capacity of first trimester immortalized trophoblast (HTR-8/SVneo) cells by 11.5% (P=.023) and 56.7% (P=.001), respectively. Pathway analysis using PCR-array and laeverin-silencing demonstrated significant downregulation of integrin A2 (39-fold), integrin B3 (5-fold), and matrix metalloprotease 1 (36-fold), indicating possible downstream effects of laeverin at the molecular level. We further investigated the expression of laeverin in placenta tissue, and maternal and fetal blood samples. Enzyme-linked immunosorbent assay analysis of laeverin protein in maternal blood showed decreasing laeverin concentration with advancing gestation during the second half of normal pregnancy. Moreover, we found that lower levels of laeverin in the maternal plasma measured at 22–24 weeks might be associated with the development of preeclampsia later in gestation. Tissue microarray analysis of 77 placentas (from 36 preeclamptic and 41 uncomplicated pregnancies) was performed to investigate laeverin protein expression differences in healthy and preeclamptic placentas. Immunohistochemistry showed that laeverin was expressed in syncytiotrophoblasts, cytotrophoblasts and extravillous trophoblasts in all placentas. All placental samples that showed cytoplasmic expression of laeverin were obtained from women delivered before 34 weeks of gestation (early-onset preeclampsia). Further, immunofluorescence studies showed laeverin expression in the cytoplasm of six preeclamptic (three early-onset and three late-onset) and one normal placenta. In summary, we demonstrated that laeverin has a role in human placentation and possible implications in the pathophysiology and clinical manifestation of preeclampsia.

Preeklampsi (svangerskapsforgiftning) er en sykdom som oppstår i 5-10% av humane svangerskap. Den defineres som nyoppstått hypertensjon med enten proteinuri og/eller organsvikt fra svangerskapsuke 20. Laeverin er en membranbundet aminopepetidase som bare uttrykkes i placenta (morkaken). Våre tidligere studier viste en 10-folds oppregulering av laeverin mRNA i preeklamptiske placenta, som dannet grunnlaget for denne doktorgradsavhandlingen. Vi valgte derfor en translasjonell tilnærming for å undersøke mulige roller for laeverin i patofysiologien til preeklampsi. Først gjorde vi immunfluorescens mikroskopisk analyse av tredje trimester placenta som viste membran uttrykk av laeverin protein i villøse trofoblaster. I preeklamptiske placenta fant vi imidlertid laeverin uttrykt ektopisk i cytoplasma, spesielt i mikrovesikler. Immunoelektron mikroskopi viste laeverin lekkasje i føtale kapillærer og rikelig uttrykk i mikrovesikler i preeklamptiske placenta. Migrasjon- og invasjons studier av første trimester immortaliserte trofoblaster (HTR-8/SVneo) celler viste reduksjon på 11.5% (P=.023) og 56.7% (P=.001), respektivt i laeverin «gene-silencing»-studier. Pathway-analyse ved bruk av PCR-array og laeverin-silencing påviste nedregulering av integrin A2 (39-fold), integrin B3 (5-fold) og matrix metalloprotease 1 (36-fold); som antydet nedstrøms effekter av laeverin på molekylært nivå. Vi gikk deretter videre med undersøkelser av laeverin uttrykk i kliniske prøver (placenta, maternelt- og føtalt blod). «Enzyme-linked immunosorbent assay»-analyse av laeverin protein i mors blod viste synkende laeverin konsentrasjon gjennom andre halvdel av normalt svangerskap. I tillegg fant vi lavere nivå av laeverin i maternelt plasma målt i uke 22-24, som kan være assosiert med utvikling av preeklampsi senere i svangerskapet. «Tissue microarray»-analyse av 77 placenta (fra 36 preeklamptiske- og 41 normale svangerskap) ble gjort for å sammenligne forskjeller i laeverin protein uttrykk i normale- og preeklamptiske placenta. Immunohistokjemiske studier viste laeverin uttrykk i syncytiotrofoblaster, cytotrofoblaster og extravilløse trofoblaster i alle placenta. Cytoplasmisk laeverin protein ekspresjon ble funnet hos kvinner som hadde tidlig-onset preeklampsi (fødsel før svangerskapsuke 34). Immunfluorescens studier viste cytoplasmisk ekspresjon i seks preeklampsi - (tre tidlig- og tre sein-onset preeklampsi) og en normal placenta. Vi har demonstrert at laeverin har en mulig rolle i patofysiologien bak preeklampsi og i klinisk uttrykk av sykdommen.