Etablering av et system for å studere funksjonelle konsekvenser av kreftspesifikke DDR2 mutasjoner

Abstract

Discoidin domene reseptor 2 (DDR2) er en unik reseptor tyrosinkinase (RTK) som aktiveres av ulike typer kollagen. DDR2 er involvert i regulering av celledifferensiering, remodelering av ekstracellulær matriks, cellemigrasjon, og celleproliferasjon. Nye studier viser at DDR2 er mutert i flere kreftformer, og spesielt lungekreft. Konsekvensen av disse kreftspesifikke mutasjoner er i midlertidig ikke kjent. Hensikten med denne oppgaven er å etablere et system som gjør det mulig å studere de funksjonelle konsekvensene av DDR2 mutasjonene i enkle cellemodeller. Setedirigert mutagenese ble benyttet for å generere mutanter av DDR2 som sammen med cDNA for villtype DDR2 ble klonet i ekspresjonsvektorer med N-terminal EGFP og Myc tagg. Vellykket transfeksjon og uttrykk av DDR2 i HEK 293T ble kun observert med N-terminal EGFP DDR2 tag. Stimulering med kollagen type I ble brukt for aktivering av overuttrykt DDR2 i HEK293 celler. Vi var ikke i stand til å detektere kollagen indusert autofosforylering av DDR2 i løpet av denne oppgaven. Flere ulike faktorer som kan ha medført mangel på DDR2 autofosforylering i våre eksperimenter ble undersøkt. Disse inkluderer serumsulting av celler dagen før stimulering med kollagen I, immunopresipitering før westernblotanalyse, ulike epitoptagger av DDR2 (C-terminal Myc, C-terminal EGFP, C-terminal FLAG, og C-terminal Cherry), ulike transfeksjonsmetoder og testing av antistoff effektivitet