Optimalisering av Rekombinant His-S100A4 produksjon i E.coli

Abstract

Metastase og invasjon er hovedårsaken til mortalitet hos kreftpasienter. Kreftforskningen verden over prøver å gi svar på hva som er mekanismen bak disse prossessene. Kreftforskningen har vist en stor interesse for Matriks metalloproteiner(MMP), pga deres økte uttrykk som er funnet i flere kreftformer. MMP er ei gruppe enzymer som er involvert i tumorinvasjon, metastasering og angiogenese. S100A4 kalsium bindende protein er vist å påvirke syntese og aktiveringen av flere MMPer. S100A4 har ingen enzymatisk aktivitet, men virker gjennom interaksjoner med ulike intracellulære og ekstracellulære bindingspartnere. Rollen til ekstracellulært S100A4 er dårlig klarlagt og forutsetningen for å kunne utføre nødvendige forsøk er at det finnes tilstrekkelige mengder ferdig produserte- og rensede S100A4-protiener Målet med prosjektet var å etablere en forbedret prosedyre for produksjon og rensing av biologisk aktivt S100A4 protein fra E Coli. Eksisterende prosedyre for S100A4 produksjon og rensing er hentet fra Radiumhospitalet i Oslo. Forskere ved Radiumshospitalet har produsert i S100A4 og har fått til biologisk aktivt S100A4 Det har dog ikke alltid vært lett å produsere og få til aktivt S100A4 protein. Flere justeringer ble gjort med prosedyren fra Radiumhospitalet. I dette prosjektet ble 4 ulike E.coli stammer brukt for å produsere S100A4 proteinet, for å se om det var noe forskjell mellom rekombinant S100A4 protein produksjon og biologisk aktivitet i de ulike bakteriestammene. Deretter ble proteinet renset på affinitetskolonne. SDS-page ble kjørt for å påvise hvor ren rS100A4 proteinet var. Oral plateepitelkarsinomcellelinjer ble bruk for å teste grad av biologisk aktivitet til det produserte proteinet. De to bakteriestammer Bl-21 star og BL-21 des ga best utbytte av renset S100A4. Renset S100A4 ble testet for aktivering av intracellulært transkripsjonsfaktoren NFkB. Dette viste at S100A4 som var produsert og renset i laben ga bedre aktivitet enn TNF-alpha (positiv kontroll til S100A4) og S100A4 som var innhentet utenfra.