Stable spirocyclic nitroxide spin labels

Abstract

Nitroxides are a class of organic radicals that exhibit remarkable stability under ambient conditions due to kinetic, thermodynamic, and electronic factors. Their unpaired electron and stability render nitroxides valuable as probes and polarisation transfer agents in spectroscopy and imaging techniques. In particular, electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy extensively utilizes nitroxides as spin labels for structural biology applications. These applications require high stability in reducing biological environments and favourable relaxation properties. Both reduction stability and relaxation parameters are heavily influenced by the nitroxide structure, specifically the nature of the substituents at the quaternary α-positions and the nitroxide ring itself. Whilst spirocyclic groups on the nitroxide scaffold provide the latter, such systems are not inherently resistant to reducing conditions. The research presented in this thesis aimed to enhance the stability of spirocyclic nitroxides through various structural modifications and apply these stable probes to investigate protein structures using EPR methods. We conducted comprehensive synthetic, conformational, and kinetic analyses of a diverse panel of spirocyclic nitroxide scaffolds, accompanied by an investigation of their relaxation parameters. We developed three practically applicable spin labels and successfully applied them in protein spin labelling. Recent experiments have demonstrated that these novel spirocyclic spin labels are promising candidates for future use in in-cell EPR measurements.

Nitroksider er en klasse organiske radikaler som er usedvanlig stabile under normale betingelser på grunn av kinetiske, termodynamiske og elektroniske faktorer. Det uparede elektronet og stabiliteten til nitroksider gjør dem nyttige som prober og polariseringsoverføringsagenter i spektroskopi og avbildningsteknikker. Særlig elektron paramagnetisk resonansspektroskopi (EPR) gjør utstrakt bruk av nitroksider som spinnmerker i anvendelser innen strukturbiologi. Disse anvendelsene krever høy stabilitet i reduserende biologiske miljøer og gunstige relakseringsegenskaper. Både stabilitet mot reduksjon og relakseringsparametre blir sterkt påvirket av strukturen til nitroksider, spesielt egenskapene til substitutentene på de kvaternære α-posisjonene og selve nitroksidringen. Mens spirosykliske substituenter på nitroksidringen gir det sistnevnte, er ikke slike systemer i seg selv motstandsdyktige mot reduserende betingelser. Forskningen presentert i denne avhandlingen hadde som mål å forbedre stabiliteten til spirosykliske nitroksider gjennom ulike modifikasjoner av strukturen deres, og anvende disse stabile probene for å undersøke proteinstrukturer ved bruk av EPR-metoder. Vi gjennomførte grundige syntetiske, konformasjonelle og kinetiske analyser av et variert panel av spirosykliske nitroksid-strukturer, sammen med en undersøkelse av relakseringsparametrene deres. Vi utviklet tre praktisk brukbare spinnmerker og anvendte dem med suksess til spinnmerking av proteiner. Nylig gjennomførte eksperimenter har vist at disse nye spirosykliske spinnmerkene er lovende kandidater for fremtidig bruk i intracellulære EPR-målinger.