Referansegen i qPCR-analyser av humane endotelceller fra koronararterier (HCAEC)

Abstract

Denne oppgaven er en del av et forskerlinjeprosjekt som ser på forskjeller i genuttrykk hos koronare endotelceller utsatt for lavt nivå av oksygen og inflammasjon sammenliknet med kontroller. Et av forsøkene hadde som hensikt å se utvikling i genuttrykk etter ulik behandlingstid.

Denne oppgaven skal bestemme hvilke referansegen som er best egnet for dette forsøkssettet ved qPCR ved hjelp av de statistiske hjelpemidlene geNorm og NormFinder.

Forsøkene ble gjort på humane endotelceller fra koronare arterier (HCAEC) med kontroller og TNF-α-stimulerte celler ved 20% og 2% O2 i tidsrommene 1, 2, 4, 6, 8 og 12 timer, n = 6. Et humant referansegenpanel med 12 gen fra TATAA Biocenter ble benyttet. Forsøkene ble utført ved bruk av humane endotelceller fra koronare arterier (HCAEC). Forsøksoppsettet bestod av fire hovedgrupper: 1) Kontroller normoksi (20% O2); 2) Kontroll hypoksi (2% O2); 3) TNF-α-stimulerte celler ved normoksi (20% O2); 4) TNF-a stimulerte celler ved hypoksi. Gruppene ble inkubert ved i førnevnte forholdene i 1, 2, 4, 6, 8 og 12 timer, n = 6. Totalt utgjorde dette oppsettet 24 ulike behandlingsgrupper. Det er derfor interessant å kartlegge hvilke kjente referansegen som er stabilt uttrykt under disse forholdene.

Et utvalg på 72 av totalt 144 prøver ble tatt med i qPCR, tilsvarende 3n av de 24 gruppene. Et humant referansegenpanel med 12 gen fra TATAA Biocenter ble benyttet. Etter qPCR ble 6 gen ekskludert fra studien grunnet dårlig effektivitet, dannelse av primer dimerer og usikker spesifisitet på PCR-produkt. GenEx fra MultiD Analyses AB ble benyttet til databehandlingen. geNorm og NormFinder er innbakt i denne softwaren. Begge metodene rangerte genene likt med RPLP og YWHAZ som de beste kandidatene. Det bør vurderes om ytterlige arbeid med å optimalisere qPCR for de ekskluderte kandidatene skal utføres, slik at de kan inkluderes i en ny analyse. I mellomtiden ansees RPLP og YWHAZ som gode nok referansegen til dette formålet.