Studie av glukokortikoidreseptoren (GR) og transkripsjonsfaktoren PAX6 i linseceller under oksidativt stress

Abstract

PAX6 er en transkripsjonsfaktor som er viktig for den normale utviklingen og funksjonen til øyet. Mutasjoner i PAX6 eller langvarig bruk av glukokortikoider er assosiert med patologiske tilstander i øyet, noe som indikerer at begge faktorene er viktig for øyets normalfunksjon. Øyet utsettes for oksidativt stress, og det er tidligere rapportert at både PAX6 og glukokortikoidreseptoren (GR) i andre vev vil kunne påvirkes av oksidativt stress. En linse-epitelcellelinje ble brukt som modellsystem, og CRISPR-Cas9 modifikasjoner er tidligere utført for å slå ut PAX6 og/eller GR. PAX6 er bekreftet slått ut. Gjennom Western blot (WB) ble det vist at GRα (97 kDa) var slått ut fra GR KO cellelinjene. GR KO cellelinjene så ut til å fortsatt inneholde en kortere isoform av GR som i en viss grad var responsiv for Dexametason (Dex). Det er studert hvilken konsekvens mangel på PAX6 og/eller GR vil ha for normale funksjoner som vekst og overlevelse. Celleproliferasjonen ble studert gjennom proliferasjons-assay, og forandring av genuttrykk ble undersøkt ved bruk av WB og qPCR. Hydrogenperoksid (H2O2)-indusert oksidativt stress ble påført cellene, for å undersøke hvordan oksidativt stress påvirker vekst og overlevelse, og om tilstedeværelsen eller fraværet av PAX6 og GR har noe å si for cellelinjenes respons. Funksjonen til PAX6 og GR som transkripsjonsfaktorer under oksidativt stress ble studert ved bruk av reportergen-assay der promotoraktiviteten ble studert. Aktivert GR (ved stimulering med Dex), og tilstedeværelse av PAX6 viste seg å spille en rolle i vekst, ved å øke celleproliferasjonen i linse-epitelcellene. Når cellene ble utsatt for H2O2-indusert oksidativt stress, viste responsen i vekst seg å være doseavhengig. Cellelinjene hvor PAX6 var fjernet var mer motstandsdyktige for oksidativt stress, sammenlignet med celler hvor PAX6 var til stede. Dette viste seg å gjelde både i en lengre tidsperiode og ved en høyere dose, før negative konsekvenser i form av lav transkripsjonsaktivitet og degradering av proteiner/celledød ble sett. Aktivering av GR viste seg og ikke ha betydelig påvirkning på celleproliferasjon under oksidativt stress.