Karakterisering av modifiserte antistoffer innen radioimmunoterapi

Abstract

Den prekliniske forskningen i farmasiselskapet Algeta har fokus på utvikling av nye behandlingsmetoder mot kreft ved bruk av målrettet alfa-terapi. I denne problemstillingen inngår bruk av modifiserte antistoffer merket med alfa-emitteren Thorium-227. Modifiseringen innebærer at en kjelator konjugeres til aminosyrene til antistoffet. Dette vil resultere i en heterogen fordeling av antall kjelatorer pr. antistoff . Denne fordelingen og det støkiometriske forholdet mellom kjelator og antistoff må karakteriseres i forbindelse med prekliniske forsøk. Masteroppgaven omhandler utvikling av en metode for å kunne karakterisere de modifiserte antistoffene. Målet med oppgaven er å utvikle en metode som skal kunne brukes til å bestemme kjelator-til-antistoff ratio (Drug to Antibody Ratio, DAR) for ulike syntesebatcher med varierende støkiometriske forhold. Delere av metoden bør kunne automatiseres og presisjonen bør være bedre enn 10%. I denne sammenhengen ble det utviklet en LC/MS basert metode for å måle konjugering av kjelatoren DOTA-NCS til antistoffet Trastuzumab ved bruk av gelkromatografi-massespektrometri. Metoden er basert på at konjugatene deglykosyleres med enzymet PNGase F og reduseres til heavy chain og light chain. DAR-verdien ble bestemt for både intakt -og redusert konjugat basert på nominelle støkiometrier fra 1:1 til 15:1. Modifiserte biologiske makromolekyler gir ofte opphav til svært komplekse massespektre på grunn av makromolekylenes størrelse samt ladningsfordelingen som følge av elektrosprayionisering. Hovedutfordringen i arbeidet har vært å utvikle en metode som gir massespektre med en kvalitet som gjør det mulig å bestemme DAR-verdier etter dataprosessering. Kvaliteten av råspekterne ble funnet å være en funksjon av signalstyrke og kompleksitet. Kompleksiteten av massespekterne til de reduserte konjugatene er mindre sammenlignet med massespekterne av intakte konjugater, noe som bidrar til sikrere bestemmelse av DAR-verdier for konjugater med nominell støkiometri over 5:1. I gelkromatografi-metoden som ble utviklet ble det brukt en kolonne med kolonnedimensjon på 2.0 millimeter indre diameter. Denne kolonnen ga ca. 5.9 ganger større signal for samme injiserte prøvemengde enn ved bruk av tradisjonell kolonnedimensjon på 4.6 millimeter indre diameter. Denne metodeforbedringen sammen med optimalisering av deglykosyleringsprosedyren og ionekildeparametere gjorde det mulig å bestemme DAR-verdier for DOTA-Trastuzumab konjugatene. Presisjonen ble gjennom partiell validering funnet til å være bedre enn 7% for alle støkiometriske forhold. Det ble vurdert at metoden er egnet til å måle antall DOTA konjugert til Trastuzumab med en nominell støkiometri fra 1:1 til 15:1 i henhold til målsettingen. Analyse av syntesebatcher med ulik støkiometri viste en tilnærmet lineær sammenheng mellom nominell DAR og funnet DAR med et reaksjonsutbytte på gjennomsnittlig 54% for intakte konjugater og 52% for reduserte konjugater (for 4 ulike støkiometrisk forhold). Dette reaksjonsutbyttet er i samme størrelsesorden som tidligere beskrevet i litteraturen. Det ble innledningsvis forsøkt utviklet omvendt fase HPLC-MS og UPLC-MS metoder, men disse ga ikke råspektre med god nok kvalitet til å kunne bestemme antall kjelatorer pr. antistoff. Alternative metoder beskrevet i litteraturen innebærer blandt annet transkjelatering fra Pb (II) arsenazo, radiometrisk titrering med Kobolt-57 eller merking av ligander med Karbon-14. Sammenlignet med disse alternativene er den utviklede LC/MS metoden relativt lite tidkrevende, ikke-radioaktiv og mer generell. I tidlig utviklingsfase innen radioimmunoterapi er det verdifullt å benytte karakteriseringsmetoder som er mer generelle fordi det åpner for mulighet til å bestemme DAR-verdier for konjugater med andre kjelatorer og eventuelt andre antistoffer.