Microbial evolution in biofilms

Abstract

Formation of biofilms is an important adaptive strategy that bacteria employ to endure challenging conditions. This thesis delves into the evolution of the pathogen <i>Vibrio cholerae</i> in biofilms with a focus on biofilm adaptation, c-di-GMP signaling and β-lactamase evolution. Paper 1 improved upon the genome of <i>V. cholerae</i> C6706 and linked every open reading frame to the current reference strain <i>V. cholerae</i> N16961. A genetic analysis identified multiple differences between <i>V. cholerae</i> C6706 and N16961. Experimental evidence suggested that these genetic differences affected biofilm formation and motility through alterations in quorum sensing and c-di-GMP turnover. Paper 2 examined biofilm adaptation during biofilm evolution. Strong selection for biofilm formation markedly improved the biofilm forming capacity of <i>V. cholerae</i> through mutations in the polyamine-regulated, bi-functional c-di-GMP-metabolizing enzyme MbaA. Mutagenesis studies and enzyme kinetics indicated that mutations in MbaA activated the diguanylate cyclase activity of the GGDEF-domain, reduced phosphodiesterase activity of the EAL-domain and decoupled MbaA from polyamine-mediated regulation via NspS. This suggests that the increase in biofilm formation comes from shifting the enzymatic output of MbaA from degradation to synthesis of c-di-GMP. Paper 3 investigated how β-lactamases affect biofilm formation in <i>V. cholerae</i> and how the biofilm lifestyle can affect the evolution of β-lactamases. A wide range of β-lactamases impaired biofilm formation in <i>V. cholerae</i>. Directed evolution coupled with selection for biofilm formation selected for mutations that reversed biofilm inhibition. This suggests that the biofilm environment can influence the evolutionary trajectories of β-lactamases. Overall, this thesis expands our understanding of the biology and evolution of <i>V. cholerae</i> and underscores the importance of understanding pathogen evolution in biofilms. Additionally, it suggests that the c-di-GMP signaling system is a potent evolutionary target for bacterial adaptation.

Biofilmdannelse er en viktig overlevelsesstrategi bakterier bruker for å tilpasse seg utfordrende miljøer. Denne avhandlingen undersøker evolusjonen av patogenet <i>Vibrio cholerae</i> med fokus på biofilmtilpasning, c-di-GMP-signalering og β-laktamaseevolusjon. Arbeid 1 forbedret genomet til modelstammen <i>V. cholerae</i> C6706 og knyttet hvert gen opp mot den nåværende referansestammen <i>V. cholerae</i> N16961. Genetisk analyse identifiserte flere mutasjoner i <i>V. cholerae</i> C6706 sammenlignet med N16961. Sammenligning av biofilmdannelse og motilitet avdekte at disse fenotypene varierer mellom <i>V. cholerae</i> C6706 og N16961. Det skyldes trolig forskjeller i quorumsansing og c-di-GMP signalering mellom <i>V. cholerae</i> C6706 og N16961. Arbeid 2 avdekte at sterk seleksjon for biofilmdannelse raskt forberedet biofilmdannelse i <i>V. cholerae</i> gjennom mutasjoner i det bifunksjonelle c-di-GMP-metaboliserende enzymet MbaA. Målrettet mutagenese og enzymkinetikk viste at mutasjoner i MbaA aktiverte diguanylat syklaseaktiviteten til GGDEF-domenet, reduserte fosfodiesteraseaktiviteten til EAL-domenet og avkoblet MbaA fra polyamin-mediert regulering via NspS. Dette tyder på at økningen i biofilmdannelse skyldes at den enzymatiske aktiviteten til MbaA endres fra degradering til syntese av c-di-GMP. Arbeid 3 undersøkte hvordan β-laktamaser påvirker biofilmdannelse i <i>V. cholerae</i> og hvordan biofilmlivsstilen kan påvirke evolusjonen av β-laktamaser. Et bredt spekter av β-laktamaser svekket biofilmdannelse i <i>V. cholerae</i>. Rettet evolusjon etterfulgt av seleksjon for biofilmdannelse selekterte for mutasjoner som reverserte biofilmhemming. Dette tyder på at biofilm-miljøet kan påvirke evolusjonen til β-laktamaser. Samlet sett utvider denne avhandlingen vår forståelse av <i>V. cholerae</i> biologi og understreker viktigheten av å forstå hvordan patogener tilapsser seg i biofilmer. Videre tyder våre funn på at c-di-GMP-signaleringssystemet er et potent evolusjonært mål for bakteriell tilpasning.