Utvikling og anvendelse av UPLC-MS baserte analyser av gentamicin i blodprøver

Abstract

Gentamicin blir brukt i behandling av alvorlige infeksjoner hos barn og voksne. For å unngå alvorlige bivirkninger må behandlingen følges opp med plasmakonsentrasjonsmålinger. I dag måles serumkonsentrasjon med immunoassay basert metode som krever 200-500 μL blod.

Formålet med prosjektet var å utvikle en LC-MS basert metode for analyse av gentamicin i små prøvevolum, samt etablere en metode som kvantifiserer de ulike forbindelsene av gentamicin.

En LC-MS metode basert på bruk av en HILIC – UPLC kolonne ble forsøkt utviklet. Dette gav symmetriske, smale topper i kromatogrammene, noe som forenkler deteksjon og kvantifisering av små mengder. Det ble ikke ble oppnådd kromatografisk separasjon mellom de ulike komponentene. Ulempen med det er fare for ionesuppresjon og at det ikke er mulig å kvantifisere individuelt de isobare forbindelsene C2, C2a og C2b.

I det videre arbeid ble derfor HILIC-kolonnen erstattet med en C18 kolonne og med heptafluorosmørsyre som ioneparsreagens i mobil fase. Deteksjon i MS ble utført både i SIR- og MRM – mode. Optimale betingelser for SIR og MRM ble etablert. I dette systemet ble god separasjon oppnådd, både mellom intern standard (Tobramycin) og gentamicin og mellom de isobare forbindelsene C2, C2a og C2b. Resultat fra analyse av rene standarder viste at metoden har potensiale i analyse av klinisk relevante konsentrasjoner, både med hensyn på linearitet, minste detekterbare og minste kvantifiserbare mengde.

Et av målene med oppgaven var å opparbeide prøvene i 96-brønnsformat. Til dette ble det benyttet OSTRO plater (96 brønns-format) med et pakkemateriale som fjerner fosfolipider i serum. Proteiner ble felt ved hjelp av acetonitril eller trikloreddiksyre før videre rensing på OSTRO systemet. I analyser av de ferdig rensede prøvene var det ikke mulig å detektere verken gentamicin eller tobramycin.